液相色譜柱的使用誤區(qū)

                                                                   液相色譜柱的使用誤區(qū)

                                                              上海連橋生物科技有限公司

         誤區(qū)：空氣會(huì)*毀滅一根HPLC色譜柱?

當(dāng)色譜柱不與色譜儀連接的時(shí)候，用戶(hù)需確保色譜柱被緊緊地密封。事實(shí)上，實(shí)際的應(yīng)用中是，即使柱的端部進(jìn)入了少量的空氣也不要緊。因?yàn)楫?dāng)你將色譜柱連接到色譜儀上使用時(shí)，在系統(tǒng)初始加壓階段，在很短的時(shí)間內(nèi)空氣就會(huì)被溶劑沖刷掉。所以，不要因?yàn)樯V柱進(jìn)入了空氣而認(rèn)定色譜柱已被損壞。?

誤區(qū)：保護(hù)柱是沒(méi)必要的

使用保護(hù)柱有很多好處。首先，保護(hù)柱可以防止化學(xué)物質(zhì)或顆粒物損壞分析柱。其次，相較之更換一根昂貴的分析柱，更換一根5mm的保護(hù)柱只需要很少的花費(fèi)。現(xiàn)代的保護(hù)柱具有幾乎無(wú)死體積、更換快速，以及適用于UHPLC的高壓等優(yōu)點(diǎn)。???

        誤區(qū)：所有的C18（L1）色譜柱都是一樣的

美國(guó)藥典委員會(huì)（USP）開(kāi)發(fā)了一種分類(lèi)系統(tǒng)，用來(lái)對(duì)每種類(lèi)型的鍵合相柱進(jìn)行分類(lèi)。由于C18色譜柱是一種廣泛應(yīng)用的色譜柱，故該系統(tǒng)將其稱(chēng)為“L1"。可惜不幸的是，大約有800種以上的L1流入了市場(chǎng)，因此，事實(shí)證明這個(gè)系統(tǒng)是不可靠的，是一個(gè)令人困惑的系統(tǒng)。??因?yàn)槊糠N商品化的C18色譜柱，雖然同樣是選用硅膠作為基體，但各自都有自己特定的填料鍵合合成工藝，因此色譜性能也不相同。譬如，有的生產(chǎn)廠商采用十八烷基一氯硅烷鍵合試劑和低表面積的硅膠，而其它一些廠家采用同一硅烷試劑但選用了表面積更高的硅膠基體。這兩種C18柱表現(xiàn)的色譜性能不同，后者C18固定相的鍵合比例大于前者。較低的固定相鍵合比率，表面未反應(yīng)的硅醇基較多，有時(shí)混合保留機(jī)理起主要作用。??

某些色譜柱生產(chǎn)商使用二氯硅烷和三氯硅烷作鍵合試劑，將鍵合相聚合反應(yīng)形成一很厚的具有不同擴(kuò)散特性的疏水層。為使鍵合后硅膠表面未反應(yīng)的硅醇基比例降低，有些生產(chǎn)商用小分子的硅烷試劑（如基氯硅烷）封尾。??

硅醇基是在中性條件下測(cè)定堿性物質(zhì)時(shí)導(dǎo)致色譜峰拖尾的原因之一，有些生產(chǎn)廠家，更進(jìn)一步的做法是采用第二種小分子硅烷進(jìn)行雙封尾工藝，以提供一個(gè)更加惰性（疏水性）的硅膠表面。??

另外有些生產(chǎn)商采用聚合物基體材料進(jìn)行C18鍵合，生產(chǎn)出一種*不同的C18填料，但仍然被歸類(lèi)到“L1"。還有廠家采用反應(yīng)性能不同的硅烷化試劑，制造出一種與氯硅烷反應(yīng)產(chǎn)生的不同的C18固定相。??

       誤區(qū)：反相色譜柱不可以使用純水相?

這個(gè)誤解其實(shí)是起源于有些用戶(hù)在使用低有機(jī)溶劑含量或者純水作為反相色譜柱的流動(dòng)相時(shí)，發(fā)生了俗稱(chēng)相塌陷的現(xiàn)象，所以大家就認(rèn)為反相色譜柱不可以使用純水相。??

許多色譜工作者都被相塌陷現(xiàn)象和保留時(shí)間位移現(xiàn)象困擾著，甚至已經(jīng)失去了努力尋找解決途徑的耐心。因此，他們索性就認(rèn)為不應(yīng)該在反相色譜柱中運(yùn)行水含量很高的流動(dòng)相。

然而，事實(shí)上市售的反相色譜柱（如極性嵌入和極性封端柱）都是具有水浸潤(rùn)性的，其表面特性是允許使用純水的，而不會(huì)導(dǎo)致塌陷或者保留時(shí)間移位。?比如科思美析COSMOSIL的C18-PAQ系列則可以使用100%水作為流動(dòng)相，適合分離親水型化合物，并相較于傳統(tǒng)的十八烷基鍵合硅膠色譜柱，具有很強(qiáng)的抗酸性。??

誤區(qū)：不可以將HPLC色譜柱反接以便于沖洗掉其中的顆粒物?

實(shí)際上HPLC色譜柱的填裝壓力比最大使用壓力高很多（通常會(huì)高2倍）。如果裝柱時(shí)使用了恰當(dāng)?shù)膭驖{劑，并且分配一定的時(shí)間使柱床穩(wěn)定，一支填裝良好的色譜柱是*可以雙向使用的。??

液相色譜柱上基本都有→標(biāo)志，表示流動(dòng)相的流動(dòng)方向，有的在色譜柱上印有“Nerver Lot Flow in the Opposite Direction"字樣，翻譯成“決不能反沖"的意思，色譜柱可以反沖嗎、色譜柱能不能反沖的問(wèn)題爭(zhēng)議很大，但在我們工作中，用色譜柱反沖技術(shù)修復(fù)色譜柱可以收到柱效提高、柱效恢復(fù)的效果。

一、分析氨基酸的離子交換柱，使用一段時(shí)間反柱效明顯下降，用NaOH活化，達(dá)不到要求，但用NaOH反沖活化可迅速恢復(fù)柱效。??

二、色譜柱使用一段時(shí)間后柱效下降，此時(shí)可拆下柱入口端螺帽，去掉1-2mm被污染填料，再用相同填料填滿(mǎn)，然后用流動(dòng)相反沖一下，可使柱效恢復(fù)，因反沖可以改善柱頭死空間。??

三、因反沖可把沉積在過(guò)渡板上的細(xì)微顆粒沖走，有時(shí)也可用反沖技術(shù)使柱壓降低。??

反向使用色譜柱有一個(gè)例外，就是生產(chǎn)商在色譜柱的進(jìn)樣端使用了孔徑更大篩板的情況，反向使用可能會(huì)將填料從柱床沖出。如果制造商在柱的入口處使用的是高孔隙率的玻璃料，那么將柱反沖的話，可能會(huì)將柱填料從填充床上沖洗掉。??

色譜柱在工廠填裝時(shí)，出口端的篩板孔徑必須比色譜柱中最小顆粒的粒徑還要小。譬如，色譜填料平均粒徑是5μm，粒徑分布范圍是3-7μm，出口端篩板孔徑必須小于3μm，使填料沒(méi)有可能從柱床跑到色譜柱篩板外面。??

大多數(shù)生產(chǎn)廠家選擇的篩板孔徑是2μm。至于某些廠家兩端的柱篩板孔徑不一樣，一般是進(jìn)樣端大些，出樣端小些。因此，一些制造商會(huì)在柱子標(biāo)簽處放置一個(gè)箭頭指示，表明必須僅在一個(gè)方向上使用。可以肯定有這種可能性，所以一個(gè)色譜工作者應(yīng)該好好閱讀色譜柱手冊(cè)或說(shuō)明書(shū)，或與制造商確定這根色譜柱是否可以反沖。??

誤區(qū)：色譜柱填料粒徑越小、壓力越高，分離效果越好?

超小的粒徑以及超高的柱壓，并不一定是色譜工作者的*！現(xiàn)代色譜柱的柱特性研究已經(jīng)引發(fā)出一些新方法來(lái)評(píng)估一根色譜柱的性能。例如，采用新的表面多孔材料的色譜柱，其柱效與sub-2μmUHPLC柱效一樣好，然而與常規(guī)的LC填料色譜柱比起來(lái)，柱壓很低。??

                                                                                                                                本篇轉(zhuǎn)載至實(shí)驗(yàn)之家