色譜定量方法

色譜定量方法
                                                             上海連橋生物科技有限公司

面積歸一法、內標法、外標法、標準加入法。這么多定量法，用哪一種呢？每一種的適用范圍是什么呢？其優缺點又是什么？其標準物又有什么要求呢？看完你就都知道了。

歸一化法

把所有出峰的組分含量之和按100%計的定量方法，稱為歸一化法。

各成分校正因子一致時可用該法，該法簡便、準確，特別是進樣量不容易準確控制時，進樣濃度及進樣量的變化的影響很小。

其他操作條件，如流速、柱溫等變化對定量結果的影響也很小。GC應用廣于HPLC。

外標法（標準曲線法、直接比較法）

首先用欲測組分的標準樣品繪制標準工作曲線。具體作法是：用標準樣品配制成不同濃度的標準系列，在與欲測組分相同的色譜條件下，等體積準確量進樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標準工作曲線，此標準工作曲線應是通過原點的直線。若標準工作曲線不通過原點，說明測定方法存在系統誤差。標準工作曲線的斜率即為絕對校正因子。

當欲測組分含量變化不大，并已知這一組分的大概含量時，也可以不必繪制標準工作曲線，而用單點校正法，即直接比較法定量。單點校正法實際上是利用原點作為標準工作曲線上的另一個點。因此，當方法存在系統誤差時（即標準工作曲線不通過原點），單點校正法的誤差較大。因此規定，y=ax+b 。b的絕對值應不大于100%響應值是y的2%。

標準曲線法的優點：繪制好標準工作曲線后測定工作就很簡單了，計算時可直接從標準工作曲線上讀出含量，這對大量樣品分析十分合適。特別是標準工作曲線繪制后可以使用一段時間，在此段時間內可經常用一個標準樣品對標準工作曲線進行單點校正，以確定該標準工作曲線是否還可使用。

標準曲線法的缺點：每次樣品分析的色譜條件（檢測器的響應性能，柱溫度，流動相流速及組成，進樣量，柱效等）很難*相同，因此容易出現較大誤差。另外，標準工作曲線繪制時，一般使用欲測組分的標準樣品（或已知準確含量的樣品），因此對樣品前處理過程中欲測組分的變化無法進行補償。

內標法

選擇適宜的物質作為欲測組分的參比物，定量加到樣品中去，依據欲測組分和參比物在檢測器上的響應值（峰面積或峰高）之比和參比物加入的量進行定量分析的方法稱為內標法。

內標法的關鍵是選擇合適的內標物。內標物應是原樣品中不存在的純物質，該物質的性質應盡可能與欲測組分相近，不與被測樣品起化學反應，同時要能*溶于被測樣品中。內標物的峰應盡可能接近欲測組分的峰，或位于幾個欲測組分的峰中間，但必須與樣品中的所有峰不重疊，即*分開。一般會選擇標準物質的同位素物質作為內標物。

內標法的優點：進樣量的變化，色譜條件的微小變化對內標法定量結果的影響不大，特別是在樣品前處理（如濃縮、萃取，衍生化等）前加入內標物，然后再進行前處理時，可部分補償欲測組分在樣品前處理時的損失。若要獲得很高精度的結果時，可以加入數種內標物，以提高定量分析的精度。

內標法的缺點：選擇合適的內標物比較困難，內標物的稱量要準確，操作較麻煩。使用內標法定量時要測量欲測組分和內標物的兩個峰的峰面積（或峰高），根據誤差疊加原理，內標法定量的誤差中，由于峰面積測量引起的誤差是標準曲線法定量的2-2，但是由于進樣量的變化和色譜條件變化引起的誤差，內標法比標準曲線法要小很多，所以總的來說，內標法定量比標準曲線法定量的準確度和精密度都要好。

標準加入法

標準加入法實質上是一種特殊的內標法，是在選擇不到合適的內標物時，以欲測組分的純物質為內標物，加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入欲測組分純物質前后欲測組分的峰面積（或峰高），從而計算欲測組分在樣品中的含量的方法。

標準加入法的優點：不需要另外的標準物質作內標物，只需欲測組分的純物質，進樣量不必十分準確，操作簡單。若在樣品的前處理之前就加入已知準確量的欲測組分，則可以*補償欲測組分在前處理過程中的損失，是色譜分析中較常用的定量分析方法。

標準加入法的缺點：要求加入欲測組分前后兩次色譜測定的色譜條件*相同，以保證兩次測定時的校正因子*相等，否則將引起分析測定的誤差。

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